بررسی کلون و بیان هورمون نوترکیب انسانی پاراتیروئید در مقیاس آزمایشگاهی

نوع مقاله : علمی-پژوهشی

نویسندگان

1 گروه بیوتکنولوژی، دانشکده مهندسی شیمی، دانشگاه صنعتی نوشیروانی، بابل، ایران

2 مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی گلستان، گرگان، ایران

چکیده

حفظ سطح غلظت کلسیم خون یک فرایند پویا است که با بر هم کنش چند عضو مانند روده، کلیه و غده ­های پاراتیروئید صورت می گیرد. هورمون انسانی پاراتیروئید (hPTH)با افزایش جذب روده ای کلسیم و کاهش دفع کلیوی موجب افزایش سطح کلسیم خون می شود. از آنجایی­ که در صورت ناکافی بودن مقدار کلسیم در خون، به طور معمول این عنصر از استخوان ­ها برداشته می­ شود بنابراین کمبود این هورمون باعث پوکی استخوان و بیماری های ناشی از اختلال­ های غده­های پاراتیروئید می­ شود. در این پژوهش از پلاسمید Puc 57  و سویه Escherichia coli DH5α برای کلون کردن و از پلاسمید Pet 32a(+) و سویه Escherichia coli BL21  برای بیان پروتئین استفاده شدند. در این پژوهش تولیدپروتئین به صورت ناپیوسته در ارلن های یک لیتری و همچنین به صورت ناپیوسته به همراه خوراک دهی در یک فرمانتور 10 لیتری همزن دار بررسی شد. طبق نتیجه های این پژوهش، کشت ناپیوسته در ارلن ها نشان داد که پس از 16 ساعتمقدار زیست توده و پروتئین نو ترکیب به ترتیب به  g/L 5/6 و  g/L 7/1  می رسد. همچنین در حالت ناپیوسته به همراه خوراک دهی، بیش ترین مقدار زیست توده و پروتئین نو ترکیب درون فرمانتور پس از 12 ساعت به ترتیب به g/L 81 و g/L22 به دست آمد. سرانجام تولید پروتئین نوترکیب با دو آزمایش SDS-PAGE   و Western blot  مورد تایید قرار گرفت.در این پژوهش وجود باند پروتئینی در  ناحیه 37 کیلو دالتون نشان دهنده درستی بیان هورمون پاراتیروئید می باشد. با توجه به تولید موفقیت آمیز هورمون انسانی پاراتیروئید در این پژوهش و همچنین مزیت های باکتری اشریشاکولی به عنوان میزبان، به نظر می­ رسد این روش می تواند جایگزین مناسبی برای تولید این ماده ارزشمند دارویی باشد. 

کلیدواژه‌ها

موضوعات


[1] Schmidt S.R, "Fusion Protein Technologies for Biopharmaceuticals", John Wiley & Sons Inc. (2013).
[2] Huang C.J., Lin H., Yang X., Industrial Production of Recombinant Therapeutics in Escherichia Coli and its Recent Advancement, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 3: 383-399 (2012).
[3] Bieglmayer  C., Prager  G.,  Niederle B., Kinetic Analyses of Parathyroid Hormone Clearance as Measured by Three Rapid Immunoassays During Parathyroidectomy, Clinical Chemistry , 48: 1731-1738 (2002).
[4] Francis S.,"Greenspan’s Basic & Clinical Endocinology", McGraw Hill (2011).
[5] Al-Badran A.E. , Abdul-Jabbar  R.A., Extraction and Purification of Recombinant Intact Human Parathyroid Hormone (hPTH) from Bacterial Cell, Journal of Biomedical Engineering and Informatics, 3(2): 1-10 (2017).
[6] Hamedifar  H., Salamat F., Saffarion  M., Ghiasi  M., Hosseini A., Lahiji  H., Mahboudi  F. A Novel Approach for High Level Expression of Soluble Recombinant Human Parathyroid Hormone(rhPTH 1-34) in Escherichia coli. Avicenna Journal of Medical Biotechnology , 5(3): 193-201.(2013).
 [7] Lövblad, K. O., Essig  M. Head and Neck Imaging. European Radiology Supplements, 2(1): 18-35 (2008).
[8] Vasicek, T.J., McDevitt  B.E., Freeman M.W., Fennick  B.J., Hendy  G.N., Potts  J. T.J., Kronenberg  H.M., Nucleotide Sequence of the Human Parathyriod Hormone Gene,  Proc Natl Acad Sci, 80: 2127-2131(1983).
[9] Gardella  T.J., Rubin  D., Abou- Samra  A.B., Keutmann H.T ., Potts  J.T., Kronenberg  H.M., Nussbaum S. R., Expression of Human Parathyroid Hormone-(1-84) in Escherchia Coli as a Factor X-Cleavable Fusion Protein. Journal of Biological Chemistry, 265:15854-15859 (1990).
[10] Guo  Q. R., Wei  D.-Z., Tong W. Y., Partial Purification oh Human Parathyroid Hormone 1-84 as a Thioredoxin Fusion form in Recombinant Escherichia Coli by Thermoosmotic Shock. Protein Expression and Purification, 49 (1): 32-8 (2006).
[11] Liu Q., Lin  J., Liu M., Tao X.,Wei  D., Ma X., Yang S., Large Scale Preparation of Recombinant Human Parathyriod Hormone 1-84 from Escherichia Coli, Protein Expression and Purification, 54(2): 212-219 (2007).
[13] Wang W., Tang  W.,Yan M., He K.,Yang  L., Jiang  L., Li H. A Bicistronic Expression Strategy for Large Scale Expression and Purification of Full-Length Recombinant Human Parathyroid Hormone for Osteoporosis Therapy, Protein Expression and Purification , 69(2): 178-85(2010).
[14] Bradford M.M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram of 1976 Bradford M.M Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding, Analytical Biochemistry, 72: 248-254 (1976).
[15] خوانچه زر س.،  هاشمی نجف آبادی س.،  محمدیان ج.، خلیل زاده ر،  اسفندیار س.، بهینه سازی شرایط کشت باکتری اشرشیا کولی برای اصلاح تولید قطعه نوترکیب باکتریورودوپسین، نشریه شیمی و مهندسی شیمی ایران، (2)32، 93 تا 101 (1392).