بهینه سازی شرایط کشت باکتری اشرشیا کولی برای اصلاح تولید قطعه C-D نوترکیب باکتریورودوپسین

نوع مقاله: علمی-پژوهشی

نویسندگان

تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده مهندسی شیمی، گروه بیوتکنولوژی، صندوق پستی 114 ـ 14115

چکیده

در بررسی حاضر، بخش CDاز پروتئین باکتریورودوپسین (BR) در اشرشیاکولی نوترکیب بیان شد. ژن موتانت BRبا در نظر گرفتن کدون مورد استفاده در اشرشیاکولی ساخته شد. ژن ساخته شده در پلاسمید بیانی pET21a+ در محل ‌های برش Nde I وHind III کلون شده و تحت کنترل پیش‌بر T7 با موفقیت بیان شد. پروتئین بیان شده با SDS PAGE تجزیه شد. اثر دما (A)، زمان القا (B)و زمان فرایند پس از القا (C) روی بازده ی میزان بیان پروتئین ( میزان فراورده بر واحد جرم خشک سلول) با استفاده از تجزیه ‌های جدول Yates غربال گری شد. سه عامل A ، B و C مهم بودند و با روش تاگوچی بهینه شدند. شرایط بهینه عبارتند از: دما oC 37، زمان القا در 7/0OD600= و زمان فرایند پس از القا 4 ساعت. همچنین، تولید پیش‌ بینی شده پروتئین در شرایط بهینه، 54 /21%  از کل پروتئین سلولی بود. با استفاده از شرایط بهینه به دست آمده، تأثیر افزودن اسیدهای آمینه روی میزان بیان بخش CD و ترکیب باکتریورودوپسین و رشد باکتری در اشرشیاکولی با استفاده از محیط کشت M9 مورد بررسی قرار گرفت. تجزیه و تحلیل جدول Yatesنشان داد که اسیدهای آمینه آلانین، ترئونین و لیوسین دارای اثر بیشتری روی بیان پروتئین بودند و برای افزودن به محیط کشت در فرمانتور در دو سطح گوناگون انتخاب شدند. نتیجه‌ ها نشان دادند که افزودن اسیدهای آمینه باعث افزایش بازده ی تولید پروتئین مورد نظر می‌  شود، اما تأثیر ناچیزی روی رشد باکتری دارد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


[1] Jong H.C., Ki C.K., Sang Y.L., Production of Recombinant Proteins by High Cell Density Culture of Escherichia coli, Chem Eng Sci., 61, p.876 (2006).
[2] Baneyx F., Recombinant Protein Expression in E.coli, Curr. Opin. Biotechnol., 10, p.411 (1999).
[3] Morten L.C., Niels T.E., Growth and Proton Exchange in Recombinant Escherichia coli BL21, Enzyme Microb. Technol., 31, p. 566 (2002).
[4] Jin Y., Girshevitz O., Friedman N., Ron I., Cahen D., Sheves M., Covalent Attachment of Bacteriorhodopsin Monolyer to Bromo-terminated Solid Supports: Preparation, Characterization, and Protein Stability, Chem Asian J., 3, p.1146 (2008).
[5] Luneburg J., Widmann M., Dathe M., Marti T., Secondary Structure of Bacteriorhodopsin Fragments, J. Biol. Chem., 273, p.28822 (1998).
[6] Nekrasova O.V., Wulfson A.N., Tikhonov R.V., Yakimov S.A., Simonova T.N., Tagvey A.I., Dolgikh D.A., Ostrovsky M.A., Kirpichnikov M.P., A New Hybrid Protein for Production of Recombinant Bacteriorhodopsin in Escherichia Coli, J. Biotechnol., 147, p.145 (2010).
[7] Xu J., Bhattacharya P., Varo G., Monolithically Integrated Bacterio- rhodopsin/semi-conductor Opto-electronic Integrated Circuit for a Bio-photoreceiver,  Biosens Bioelectron., 19, p.885 (2004).
[8] Pompejus M., Friedrich K., Teufel M., Fritz H.J., High-Yield Production of Bacteriorhodopsin via Expression of a Synthetic Gene in Escherichia coli, Eur. J. Biochem., 211, p. 27 (1993).
[9] Lee S.Y., Chang H.N., Um Y.S., Hong S.H., Bacteriorhodopsin Production by Cell Recycle Culture of Halobacterium Halobium, Biotechnol Lett., 20, p.763 (1998).
[10] Xu J., Stickrath A.B., Bhattacharya P., Nees J., Varo G., Hillebrecht J.R., Ren L., Birge R.R., Direct Measurement of the Photoelectric Response Time of Bacteriorhodopsin via Electro-Optic Sampling, Biophys. J., 85, p.1128 (2003).
[11] Walter J., Greenfield D., Liphardt J., Potential of Light-Harvesting Proton Pumps for Bioenergy Application, Curr. Opin. Biotechnol., 21, p.265 (2010).
[12] Oren A., Industrial and Environmental Applications of Halophilic Microorganisms, Environ. Technol., 31, p.825 (2010).
[13] Marti T., Refolding of Bacteriorhodopsin from Expressed Polypeptide Fragments, J. Biol. Chem., 273, p.9312 (1998).
[14] Santosh O., Ramchuran O.H., Eva, N.K., Effect of Postinduction Nutrient Feed Composition and Use of Lactose as Inducer During Production of  Thermostable Xylanase in E.scherichia coli Glucose-limited Fed-batch Cultivations, J. Biosci. Bioeng., 99, p.477 (2005).
[15] Yee L., Blanch H.W., Defined Media Optimization for Growth of Recombinant Escherichia coli, Biotechnol Bioeng., 41, p.221 (1993).
[16] Khalilzadeh R., Shojaosadati S.A., Bahrami A., Maghsoudi N.,Fed-batch Cultivation of Recombinant Escherichia coli Producing Human Interferon-γ under Controlled Specific Growth Rate, Iran J Biotechnol., 2, p.113 (2004).
[17] Shojaosadati S.A., Varedi Kolaei S.M., Babaeipour V., Farnoud A.M., Recent Advances in High Cell Density Cultivation for Production of Recombinant Protein, Iran. J. Biotechnol., 6, p.63 (2008).
[18] Sandén A.M., Prytz I., Tubulekas I., Förberg C., Le H., Hektor A., Neubauer P., Pragai Z., Harwood C., Ward A., Picon A., De Mattos J.T., Postma P., Farewell A., Nyström T., Reeh S., Pedersen S., Larsson G., Limiting Factors in Escherichia coli Fed-Batch Production ofRecombinant Proteins, Biotech Bioeng., 81, p. 158 (2003).